Свято-Духовский храм и возникший под его сенью монастырь в течение почти двух веков оставался единственным православным храмом в Вильнюсе. В этом храме в самые трудные минуты для православных раздавалось слово утешения святой веры. В этом святом храме с давних пор находятся нетленные мощи святых Виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия.

После заключения в 1596 году Брестской унии, предполагавшей не только объединение Литвы и Польши в одно государство, но и объединение православной и католической Церкви с признанием главенства Римского папы и догм католической Церкви, для православных Литвы наступили тяжелые времена. Все приходские церкви в Вильне были закрыты, Свято-Троицкий монастырь был отдан униатам.
Но народ виленский боролся за свою святую православную веру. После многих отказов, в 1597 году Свято-Троицкое братство получило от короля Сигизмунда III разрешение построить новую церковь на Большой улице, почти напротив Св.-Троицкой обители. Первоначально церковь была возведена из дерева, на земле, принадлежавшей двум именитым сестрам Феодоре и Дорофее-Анне, урожденным Волович, и ими передана в собственность братству, которое стало группировать около этой святыни свои силы и свои учреждения - училище, типографию, богадельни и т.п.

Училище, именуемое коллегией в научном отношении стояло довольно высоко. Оно состояло из пяти классов, и в нем преподавались все те же науки, что и в вильнюсской иезуитской академии. Для студентов этого училища в 1618 году были составлены и напечатаны под Вильной первые в России "Словарь" и "Словенская Грамматика". По ним, как известно, и что составляет предмет гордости Вильны, учились тысячи людей, в том числе и великий Михайло Ломоносов.
Параллельно с просветительством шла работа по возведению вместо деревянного - каменного храма, который "с благоукрашением внутренним соединил бы и представительность внешнюю..." Храм был полностью закончен к 1640 году. В руках православных Свято-Духов монастырь оставался всегда и в этом отношении он примечателен как единственная в Вильнюсе православная церковь, не бывшая в руках униатов. Свято-Троицкое братство еще в 1588 году от Константинопольского патриарха получило право ставропигии, т.е. оно непосредственно подчинено было Константинопольскому патриарху и не зависело от местной церковной власти. Переселившись из Троицкого монастыря, братство передало это право Св.-Духову монастырю, и потому все православные монастыри в Литве, мужские и женские, были подчинены Св.-Духову монастырю.

В начале XVIII века шведы разорили монастырь и церковь. Большую материальную помощь в его восстановлении оказал в 1708 году Петр I.
Частые опустошительные пожары, которым не раз подвергался Вильнюс, не щадили и Св.-Духова монастыря. В 1749 году он сгорел вместе с церковью. Остались одни стены.
Церковь сильно пострадала в 1812 году. Солдаты Наполеона устроили в ней кухню, испортили иконостас, сожгли царские врата, взломали полы, закоптили стены.

После войны храм был приведен в наилучший вид - средства на это выделил виленский купец первой гильдии Александр Николаевич Слуцкий. Позднее появилось общее отопление, а при архиепископе Алексии была заново отделана вся церковь и приведена в то состояние, в котором она находится теперь. Наружный вид церкви стал таким, каким мы его видим сегодня.
В 1837 году, при императоре Николае I, из царской казны были выделены средства на ее переустройство.